大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定-神经解剖学杂志

大鼠VGLUT2基因shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

作者：姜俊[1] 高凡[1] 葛顺楠[2] 李志红[2] 唐君[2] 李金莲[2]

单位：第四军医大学口腔医学系2008级,西安,710032第四军医大学人体解剖学教研室暨梁銶琚脑研究中心,西安,710032

分类号：Q78

出版年·卷·期（页码）：2011·27·第六期（1-1）

摘要：

目的:构建可以表达针对2型囊泡膜谷氨酸转运体(VGLUT2)shRNA的慢病毒载体,特异性下调中枢神经系统内VGLUT2的表达,从而为研究VGLUT1和VGLUT2的功能差异提供有力的工具.方法:首先在体外合成四对互补并靶向作用于编码大鼠VGLUT2序列四个位点的特异性短发卡RNA(short hairpin RNA)序列和一个阴性对照的寡核苷酸,克隆到pGCSIL-GFP质粒(经AgeI和EcoRl双酶切)载体内,经酶切及测序鉴定正确后,将该质粒与辅助质粒pHelper1.0以及pHelper2.0共转染T293细胞,包装得到病毒颗粒.各组病毒载体转染原代培养的大鼠皮层神经元后,运用免疫荧光和Western Blot检测各组蛋白的表达水平.结果:pGCSIL-GFP质粒克隆得到的VGLUT2 shRNA序列正确,包装得到的病毒可以有效转染原代培养的皮层神经元,Western Blot检测结果显示:VGLUT2 shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比有显著性差异(P＜0.05),分别为空白组的63.9 ±5.82％,73.8 ±3.18％:VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组的VGLUT2表达水平与空白组相比同样有显著性差异(P＜0.05),分别为空白组的39.1 ±1.99％,35.1±1.72％:VGLUT2shRNA-1与VGLUT2 shRNA-2病毒组相比无显著性差异(P＞0.05);但VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4病毒组与VGLUT2 shRNA-1和VGLUT2 shRNA-2病毒组相比有显著性差异(P＜0.05).表明VGLUT2 shRNA-3与VGLUT2 shRNA-4组病毒能较为高效的下调培养的皮层神经元VGLUT2的表达,下调效率超过60％.结论:本研究成功构建出表达针对大鼠VGLUT2基因shRNA的慢病毒载体,并可有效下调VGLUT2的表达,为进一步研究VGLUT2的功能及其与VGLUT1之间的功能差异提供了有力的工具.

参考文献：

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